Использование молекулярно-генетических методов в микробиологической практике

На данный момент использование молекулярно-генетических методов прочно занимает одно из важнейших мест в современной микробиологии. Бурное развитие науки и технический прогресс позволяют исследовать ДНК, создавать микроорганизмы с заданными свойствами и получать нужные для производства белки и ферменты. А также создание генетических конструкций необходимо для изучения свойств организмов и для дальнейшего его применения в биологии и медицине[1].

---

На Work5 заказать курсовую срочно в Хабаровске - не проблема.

---

. Открытие полимеразной цепной реакции(ПЦР) стало настоящим событием в мире диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. Впервые этот метод был описан в 1983 году и самый рейтинговый всемирный научный журнал "Science" назвал эту работу самым выдающимся открытием последних лет. А Кэрри Мюллис, впервые предложивший этот метод, был удостоен нобелевской премии в области химии в 1993 году. Следует отметить, что это стало беспрецедентным событием в области биологии и химии, так как впервые нобелевскую премию присудили не за открытие механизма, или принципа работы той или иной биологической системы, а за метод амплификации генов. Чем же так замечателен ПЦР, и почему его открытие стало настоящей революции в диагностике и медицине? Появление метода ПЦР было бы невозможным без предпосылок к его открытию. Ими стали значительные успехи в области молекулярной биологии. В том числе: открытие структуры ДНК, расшифровка нуклеотидной последовательности микроорганизмов и другие. Решающим моментом стало открытие taq-ДНК-полимеразы, которая содержится у микроорганизмов, обитающих в гейзерах[2]. Эта полимераза способна работать при высоких температурных условиях(выдерживает нагревание до температуры кипения воды без потери активности). Изящность, простота исполнения, высокая специфичность и принесли новому методу небывалую популярность. Практически все лаборатории мира, которые занимаются генетическими исследованиями взяли этот метод на вооружение. С помощью ПЦР стали возможными потрясающие научные открытия, и его резерв еще далеко не исчерпан. Помимо научного применения, ПЦР широко распространился в области медицинской диагностики. Этот метод позволяет значительно экономить драгоценное время и если раньше диагностика заболеваний включала в себя множество трудоемких этапов, таких как культивирование микроорганизмов, и занимала почти неделю, то ПЦР позволил сократить это время до 5 часов[3]. С помощью ПЦР возможны диагностика инфекционных и вирусных заболеваний, пренатальная диагностика, определение степени родства, генотипирование микроорганизмов, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, биологический контроль препаратов крови и многое другое.

Возможности, заложенные в методе ПЦР позволяют достигать максимальной специфичности анализа, а так же проводить генотипирование. Другим достоинством метода является то, что для проведения множественного количества анализов на различные заболевания необходим один и тот же набор реагентов. ПЦР не требует проведения культуральных и микробиологических процедур , что занимает значительное количество времени. Время проведения ПЦР вместе с пробоподготовкой занимает 12 часов. А использование стандартных процедур выделения ДНК из тканей человека и животных может сократить пробоподготовку до 4-4,5 часов. Это может быть важным фактором для определения вирусов СПИДа и ВИЧа например на станциях переливания крови. ПЦР эффективен как метод диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, поскольку позволяет миновать стадию культивирования этих микроорганизмов в лабораторных условиях. ПЦР-диагностика применима для возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Так же метод применим не только к клиническим материалам, но и способен выявлять возбудителей в почве, воде и продуктах питания. ПЦР обладает уникальной чувствительностью и специфичностью, позволяет непосредственно обнаружить инфекционный возбудитель и дает возможность генотипирования любого гена человека, что определяет его широкую область применения в клинической диагностике и лабораторной практике. С каждым годом разрабатываются десятки новейших тест-систем для ПЦР- анализа, которые предназначены как для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов - возбудителей заболеваний, так и для исследования генов человека. Себестоимость этого метода ежегодно понижается, что способствует его более широкому использованию в лечебных и диагностических учреждениях. Неуклонно растет количество ПЦР-лабораторий в странах СНГ, что способствует тому, что в скорейшем времени ПЦР-анализ станет одним из самых популярных методов лабораторной диагностики.

1. Matic I., Taddei F., Radman M. Genetic barriers among bacteria // Trends Microbiol. 1996. Vol. 4. P. 69–72. 2. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с. 3. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с. 4. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003. 480 с. 5. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М.: Мир, 1967. 461 с. 6. Sharp P.A. Split genes and RNA splicing // Cell. 1994. Vol. 77. P. 805–815. 7. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 528 с. 8. Френкель-Конрат Х. Химия и биология вирусов. М.: Мир, 1972. С. 15. 9. Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. 491 с. 10. Гвоздев В.А., Алаторцев В.В., Аравин А.А. и др. Гетерохроматин: Молекулярная эволюция и эффекты положения генов у Drosophila melanogaster // Молекуляр. биология. 1999. Т. 33. С. 14-25. 11. Гвоздев В.А. Гетерохроматин (структура, молекулярная эволюция и регуляторные взаимодействия) // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Т. 1. Москва. Наука, 2003. С. 15-27. 12. Миндлин С.З., Басс И.А., Богданова Е.С. и др. Горизонтальный перенос генов в природных популяциях бактерий. Гены и транспозоны устойчивости к соединениям ртути // Проблемы и перспективы молекулярной генетики. М. Наука. 2003. С. 124-146. 13. Smith D.B., Johnson K. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase // Gene. 1988. Vol. 67. P. 31–40. 14. Прозоров А.А. Трансформация у бактерий. М.: Наука, 1988. 255 с. 15. Жакоб Ф., Вольман Э. Пол и генетика бактерий. М: Изд. Иностр. Лит. 1962, 476 С. 16. Molecular cloning. A Laboratory manual on the WEB. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2002. http://www.molecularcloning.com 17. Alkami Quick Guide™ for PCR. A laboratory reference for the polymerase chain reaction. 1999. http://www.alkami.com 18. PCR in situ hybridization. 3rd ed., Philadelphia: Lippincott-Raven, 1998 19. Patrushev L.I., Zykova E.S., Kayushin A.L. et al. New DNA diagnostic system for detection of Factor V Leiden // Thrombosis Res. 1998. Vol. 92. P. 251-259. 20. Wilson R., Oliver J., Brookman J.L. et al. Development of a semi-permeabilised cell system to study the translocation, folding, assembly and transport of secretory proteins // Biochem. J. 1995. Vol. 307. P. 679–687. 21. Farmery M.R., Allen S., Allen A.J., Bulleid N.J. The role of ERp57 in disulfide bond formation during the assembly of MHC class I in a synchronized semi-permeabilised cell translation system // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 14933–14938. 22. Jermutus L., Ryabova L.A., Pl?ckthun A. Recent advances in producing and selecting functional proteins by using cell-free translation // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. Vol. 9. P. 534–548. 23. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. Vol. 230. P. 1350-1354. 24. Mullis KB, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction // Meth. Enzymol. 1987. Vol. 155. P. 335-350. 25. Alkami Quick Guide™ for PCR. A laboratory reference for the polymerase chain reaction. 1999. http://www.alkami.com 26. Sarkar G., and Sommer S.S. Shedding light on PCR contamination // Nature. 1990. Vol. 343. P. 27. 27. Prince A.M., Andrus L. PCR: How to kill unwanted DNA // Biotechniques. 1992. Vol. 12. P. 358–360. 28. De Filippes F.M. Decontaminating the polymerase chain reaction // Ibid. 1991. 10. 26–30. 29. Espy M.J., Smith T.F., Persing D.H. Dependence of polymerase chain reaction product inactivation protocols on amplicon length and sequence composition // J. Clin. Microbiol. 1993. Vol. 31. 2361–2365. 30. Furrer B., Candrian U., Wieland P., Luthy J. Improving PCR efficiency // Nature. 1990. Vol. 346. P.324. 31. Meier A., Persing D.H., Finken M., Bottger E.C. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: Implications for a general approach to detection of uncultured pathogens // J. Clin. Microbiol. 1993. Vol. 31. 646–652. 32. Walsh, P. S., D. A. Metzger, R. Higuchi. Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // Biotechniques. 1991. Vol. 10. P. 506–513. 33. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Envir. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 3741–3751. 34. Nichols R.C., Raben N. Hints for direct sequencing of PCR-generated single-stranded DNA // Biotechniques. 1994. Vol. 17. P. 412–414. 35. Dale J.W., von Schantz M. From genes to genomes. Concepts and applications of DNA Technology. N.Y.: Wiley, 2002. 36. Horton, R.M., Hoppe, B.L., Conti-Tronconi, B.M. AmpliGrease: 'Hot Start' PCR Using Petroleum Jelly // Biotechniques. 1994. Vol. 16. P. 42-43. 37. Kellogg D.E., Rybalkin I., Chen S. et. al. TaqStartTM Antibody: "Hot Start" PCR Facilitated by a Neutralizing Monoclonal Antibody Directed Against Taq DNA Polymerase // Biotechniques. 1994. Vol. 16. 1134-1137. 38. Birch D.E. Simplified hot start PCR // Nature. 1996. Vol. 381. P. 445-446. 39. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264. P. 268-278. 40. Brownie J., Shawcross S., Theaker J. et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 3235-3241.