Разработка технологии производства бионалога трастузумаба

Высокие цены на биофармацевтические или биологические препараты, используемые при лечении многих заболеваний, ограничивают доступ пациентов к этим новым методам лечения. Одним из примеров является моноклональное антитело трастузумаб, успешно применяемое для лечения рака молочной железы. Экономической альтернативой является производство биоаналогов к этим дорогостоящим биофармацевтическим препаратам. Поскольку терапия антителами может потребовать больших доз в течение длительного периода времени, надежные платформы и стратегии для разработки клеточных линий необходимы для получения рекомбинантных клеточных линий с более высокими уровнями экспрессии.

---

На Work5 вы можете заказать недорого контрольную работу в Хабаровске и не переживать за качество.

---

Здесь мы получили экспрессирующие трастузумаб клетки CHO-K1 с помощью стратегии скрининга и отбора, которая сочетала использование клеток-хозяев, предварительно адаптированных к среде без белка, и суспензионной культуре, и лентивирусных векторов. Результаты показали, что стратегия раннего скрининга позволила получить рекомбинантные популяции клеток CHO-K1 с более высоким содержанием клеток, экспрессирующих IgG. Более того, измерение внутриклеточного полипептида с тяжелой цепью методом проточной цитометрии было полезным показателем для характеристики однородности клеточной популяции, и наши результаты предполагают, что это может быть использовано для прогнозирования уровней экспрессии моноклональных антител на ранних стадиях развития клеточной линии. Кроме того, мы предлагаем подход с использованием 25 см2 Т-колб в условиях суспензии и встряхивания культуры в качестве инструмента скрининга для выявления высокопродуктивных клеточных линий. Наконец, экспрессирующие трастузумаб клоны CHO-K1 были получены и охарактеризованы с помощью периодического культивирования, и предварительные результаты, относящиеся к способности распознавать HER2, были успешными. Дальнейшая оптимизация таких элементов, как оптимизация генов, селекция векторов, тип системы амплификации/селекции, состав среды для культивирования клеток, в сочетании с этой стратегией позволит получать высокопродуктивные клоны. Выдающиеся достижения трастузумаба в клинических условиях вошли в историю систематического лечения рака молочной железы. К сожалению, он не всегда доступен для обычного использования из-за его непомерно высокой стоимости (Pivot и Petit 2018). Истечение срока действия патента Европейского союза (ЕС) на трастузумаб в 2014 году и последняя версия патента США в 2019 году (Nelson 2014) способствовали разработке биоаналогов к этому антителу (Curigliano et al., 2016). Биоаналоги, по прогнозам, будут на 20-30% дешевле эталонного продукта. По этой причине ожидается, что он окажет положительное влияние с точки зрения экономической эффективности и повышения доступности и доступности таргетных методов лечения (Paplomata и Nahta 2018). Чтобы гарантировать доступ кубинских пациентов к этой непомерно дорогой терапии, Центр молекулярной иммунологии (CIM, Гавана, Куба) решил разработать биоаналог трастузумаба, продуцируемого клетками CHO-K1.Использование клеток CHO для производства терапевтических белков имеет много преимуществ, таких как более легкая адаптация к выращиванию в средах без сыворотки и / или химически определенных средах, способность достигать высокой плотности клеток в суспензионной культуре, высокий титр продукта и сходные схемы гликозилирования с клеточными линиями человека (Bandaranayake and Almo 2014; Kim et al. др., 2012; Кейстерманс и Аль-Рубеаи, 2015a; Спирмен и Батлер, 2015). В настоящее время платформы на основе клеток CHO используют клетки, предварительно адаптированные для выращивания в химически определенных средах без сыворотки и суспензионной культуре, чтобы сократить время и усилия, связанные с адаптацией рекомбинантных клеточных линий CHO (Jostock 2011; Kim et al. 2012). Кроме того, эти клетки могут быть легко трансдуцированы с использованием лентивирусных векторов (LVS) (Gaillet et al. 2010; Oberbek et al. 2011). Этот метод трансфекции использует преимущества механизмов LV для стабильной интеграции в хромосоме клеток, в частности, в транскрипционно активные области. Эта особенность делает их отличными инструментами для получения клеточных линий с высокими уровнями экспрессии целевых рекомбинантных белков (Gödecke et al. 2018; Mursi and Masuda 2018). LVs как метод переноса генов предоставляет дополнительные возможности для оптимизации, поскольку позволяет регулировать соотношение вируса и клеток (множественность инфекции, MOI) для модуляции количества копий трансгена и / или процента инфицированных клеток (Gödecke et al. 2018; Oberbek et al. 2011).После того, как клетки трансфицированы, следующим важным шагом является идентификация желательных вариантов или клонов из гетерогенного пула трансфектантов (Priola et al., 2016). Было использовано несколько методов, от автоматизированных методов клонирования, таких как ClonePix FL ™ и Cello™ system, до ручных методов, таких как клонирование с ограничением разведения (Kuystermans and Al-Rubeai 2015b).Что касается продукции антител, в нескольких отчетах была продемонстрирована положительная корреляция между продуктивностью (объемной или специфической) и уровнями мРНК или внутриклеточных полипептидов легкой цепи (LC) или тяжелой цепи (HC) с использованием проточной цитометрии. Несмотря на противоположные результаты по этому вопросу (Borth et al. 1999; Chusainow et al. 2009; Dorai et al. 2006; Edros et al. 2013; Jiang et al. 2006; Lattenmayer et al. 2007; Lee et al. 2009; Park and Ryu 1994; Roy et al. 2017), будет важно проверить, могут ли эти переменные предсказывать уровни экспрессии целевых антител на ранней стадии процесса разработки клеточной линии, чтобы сократить время получения рекомбинантных клеточных линий. В настоящей работе мы создали несколько экспрессирующих трастузумаб клеточных линий, следуя иной стратегии, чем ранее использовавшейся для получения других биоаналогичных кандидатов из клеток NS0 и клеток CHO-K1 в CIM (неопубликованные данные). В этих случаях весь процесс разработки клеточной линии и оценки продуктивности проводили в среде с добавлением сыворотки и в адгезивной культуре с последующим этапом адаптации суспензии без сыворотки. Здесь мы объединили использование клеток CHO-K1, предварительно адаптированных для роста в среде без белка и суспензионной культуре, трансдукцию лентивирусными векторами, этап раннего скрининга и раннюю адаптацию рекомбинантных клеточных линий, полученных в вышеупомянутых условиях. Кроме того, оценка уровней экспрессии и скрининг продуцирующих клеточных линий проводились в условиях, более похожих на условия конечного производственного процесса. Наши результаты показывают, что измерение внутриклеточного полипептида HC методом проточной цитометрии может быть использовано для прогнозирования уровней экспрессии моноклональных антител на ранних стадиях. Это было бы выгодным подходом для отбора пулов клеток-предшественников, обогащенных высокопродуктивными клонами. Кроме того, биоаналоги к экспрессирующим трастузумаб клонам были охарактеризованы с помощью пакетной культуры. Наконец, способность рекомбинантного антитела распознавать молекулу HER2, экспрессируемую в линиях опухолевых клеток, оценивали методами проточной цитометрии.

Биологический лекарственный препарат – это препарат, в котором фармацевтическая субстанция является биологической, т.е. производимая биологическим источником или из него получаемая. Понятие биологического лекарственного препарата дано в ч. 1 Дополнения 1 Директивы 2001/83/EC, где сказано, что «к биологическим источникам относятся: микроорганизмы, органы и ткани растительного или животного происхождения, клетки или жидкости (включая кровь и плазму) человеческого или животного происхождения и биотехнологические клеточные конструкции (клеточные субстраты, независимо от того, являются ли они биотехнологическими, включая первичные клетки)». Понятие, закрепленное в ст. 4 Федерального закона № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (далее ФЗ-№ 61), в целом схоже с понятием, данным в Директиве ЕС. Биологические лекарственные препараты – лекарственные препараты (далее ЛП), действующее вещество которых произведено или выделено из биологического источника и для определения свойств и качества которых необходима комбинация биологических и физико-химических методов. Трастузумаб, успешно применяемое для лечения рака молочной железы. Экономической альтернативой является производство биоаналогов к этим дорогостоящим биофармацевтическим препаратам. Дальнейшая оптимизация таких элементов, как оптимизация генов, селекция векторов, тип системы амплификации/селекции, состав среды для культивирования клеток, в сочетании с этой стратегией позволит получать высокопродуктивные клоны.

Петерсона, Б.Е. Атлас онкологических операции [текст] / Под редакцией чл.-корр. АМН Б.Е.Петерсона, проф. В.И.Чиссова, проф.А.И.Пачеса. – Москва «Медицина», 1987. – 533с. 2. Ашрафян, Л.А, Опухоли репродуктивных органов (этиология и патогенез) [текст] / Л.А. Ашрафян, В.И. Киселев – Москва, 2007. – 208с. 3. Бахидзе, Е.В. Фертильность, беременность и гинекологический рак [текст] / Е.В. Бахидзе – Москва – Санкт-Петербург «Диля», 2004. –285с. 4. Берштейн ,Л.М. Гормональный канцерогенез [текст] / Л.М. Берштейн – Санкт-Петербург «Наука», 2000. – 197с. 5. Биссет, Р, Дифференциальный диагноз при абдоминальном ультразвуковом исследовании [текст] / Р. Биссет, А. Хан– М., 1996 6. Бохман, Я.В. Руководство по онкогинекологии [текст] / Я.В. Бохман– Л.: Медицина, 1989 7. Бохман ,Я.В , Полинеоплазии органов репродуктивной системы [текст] / Я.В.Бохман, Е.П. Рыбин – Санкт-Петербург, 2001. –239с. 8. Вишневская, Е.Е, Ошибки в онкогинекологической практике: Справ. Пособие [текст] / Е.Е. Вишневская, Я.В. Бохман – Мн.: Выш. Шк., 1994. – 288 с. 9. Вишневская, Е.Е. Предопухолевые заболевания и злокачественные опухоли женских половых органов [текст] / Е.Е. Вишневская – Минск «Вышэйшая школа», 2002. – 415с. 10. Вуд, М, Секреты гематологии и онкологии: пер. с англ. [текст] / М . Вуд, П. Банн – М.: «Издательство Бином», 1997. – 560с. 11. Гарин, А.М. Принципы и возможности современной эндокринной терапии опухолей (медицинское издание) [текст] / А.М. Гарин – М.: Издательство «Просветитель», 2000. – 208 с. 12. Гершанович, М.Л. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей [текст] / М.Л. Гершанович, В.А. Филов, М.А. Акимов, А.А. Акимов – СПб.: Сотис, 1999. – 152 с. 13. Грушина,Т.И. ,Физиотерапия у онкологических больных [текст] / Т.И. Грушина– Москва «Медицина», 2001. – 207с. 14. Давыдов, М.И, Рак легкого [текст] / М.И. Давыдов, Б. Е. Полоцкий – «Радико», 1994 15. Дарьялова, С.Л, Диагностика и лечение злокачественных опухолей [текст] / С.Л. Дарьялова, В.И. Чиссов – Москва «Медицина», 1993. – 253с 16. Белогурова, М.Б.Детская онкология. Руководство для врачей [текст] / Под редакцией М.Б.Белогуровой. – Санкт-Петербург, 2002. – 351с. 17. Блинов, Н.Н. Диагностика злокачественных опухолей при диспансеризации населения [текст] / Под редакцией Н.Н. Блинова, А.Г.Веснина, Ю.Г.Пучкова. – Санкт-Петербург, 1994. – 223с. 18. Долгих, В.Т. Опухолевый рост [текст] / В.Т. Долгих – Москва «Медицинская книга»,2001, 79с. 19. Иконописов, Р. Пигментные опухоли [текст] / Р. Иконописов, Р. Райчев - София, 19976. 20. Имянитов, Е.Н, Молекулярная онкология: клинические аспекты [текст] / Е.Н. Имянитов, К.П. Хансон – Санкт – Петербург, 2007. – 211с. 21. Чиссов, В.И, Избранные лекции по клинической онкологии [текст] / Под редакцией академика РАМН В.И.Чиссова, профессора С.Л.Дарьяловой. – Моска, 2000, 734с. 22. Искендеров, Ф. Злокачественные опухоли надпочечников: дисс. д-ра.мед.наук, / Ф. Искендеров, -ВОНЦ, 1995 23. Киселев, В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки [текст] / В.И. Киселев – Москва, 2004. – 179с. 24.Козаченко, В.П. Клиническая онкогинекология: Руководство для врачей [текст] / Под редакцией В.П.Козаченко. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 376с. 25. Моисеенко, В.М, Клиническая онкология (избранные лекции) I Том [текст] / Под редакцией В.М. Моисеенко, А.Ф. Урманчеевой – Санкт – Петербург, 2006. – 175с. 26. Моисеенко, В.М, Клиническая онкология (избранные лекции) II Том [текст] / Под редакцией В.М. Моисеенко, А.Ф. Урманчеевой - Санкт – Петербург, 2006. – 255с. 27. Митьков, М.Д. Клиническое руководство по ультразвуковой диагностике [текст] / Под ред. М.Д. Митькова в 5-ти томах. – М., 1997 28. Колосов, А.Е, Рецидивы злокачественных опухолей и прогноз для больных [текст] / А.Е. Колосов, А.Г. Захарьян – Киров, 1995. – 447с. 29. Мерабишвили, В.М, Контроль качества онкологической помощи населению с использованием современных информационных систем. Пособие для врачей [текст] / Под редакцией проф. В.М.Мерабишвили. проф. В.В.Старинского. – Санкт-Петербург, 2005. – 61с. 30. Колосов, А.Е. Опухоли яичников и прогноз для больных: Руководство для врачей [текст] / А.Е. Колосов – Киров, 1996. – 240 с. 31. Моисеенко, В.М. Лекции по фундаментальной и клинической онкологии [текст / Под редакцией В.М.Моисеенко, А.Ф.Урманчеевой, К.П.Хансона. - Издательство Н-Л, 2004.- 703с. 32. Лелюк, С.Е, Комплексное ультразвуковое исследование сосудов [текст] / С.Е. Лелюк, В.Г. Лелюк - М, 1998 33. Летягин, В.П. Рак молочной железы (эпидемиология, классификация, диагностика, лечение, прогноз) [текст] / В.П. Летягин, К.П. Лактионова, И.В. Высоцкая, В.А. Котов - М., " Медицина ", 1996 34. Летягин, В.П, Первичный рак молочной железы (диагностика, лечение, прогноз) [текст] / В.П. Летягин, И.В.Высоцкая - М., 1996 35. Летягин, В.П. Редкие формы рака молочной железы [текст] / В.П. Летягин, К.П. Лактионов, В.Д. Ермилова и др. - М." Медицина ",1995 36. Мартов, А.Г. Рентген - эндоскопические методы диагностики и лечения заболеваний почек и верхних мочевых путей: дисс. д-ра.мед.наук,/ А.Г. Мартов, -НИИ урологии, 1993 37. Матвеев, Б.П. Рак предстательной железы [текст] / Б.П. Матвеев, Б.В. Бухаркин, В.Б. Матвеев - М, 1999 38. Материалы Российских онкологических конгрессов 2000-2008 гг. 39. Михайлов, А.Н. Лучевая диагностика в гастроэнтерологии [текст] / АН. Михайлов – М., 1994 40. Чиссов, В.И,Опухоли [текст] / Под редакцией акад. РАМН В.И.Чиссова, проф. С.Л.Дарьяловой. – Москва «ГЭОТАР-Медиа»,2006 41. Чёсов ,В.И, Ошибки в клинической онкологии: Руководство для врачей [текст] / Под ред. В.И. Чиссова, А.Х. Трахтенберга. – М.: Медицина, 1993. – 539с. 42. Краевский, И.А. Патолого - анатомическая диагностика опухолей человека. Руководство для врачей. Том I. [текст] / Под редакцией И.А.Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. – Москва «Медицина», 1993. – 559с. 43. Краевский, И.А. Патолого - анатомическая диагностика опухолей человека. Руководство для врачей. Том II. [текст] / Под редакцией И.А.Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. – Москва «Медицина», 1993. – 689с. 44. Mantarro S. Risk of severe cardiotoxicity following treatment with trastuzumab: a meta-analysis of randomized and cohort studies of 29,000 women with breast cancer / Mantarro S., Rossi M., Bonifazi M. et al. // Internal and Emergency Medicine. - 2015. – Vol. 11(1). - P. 123–140. doi:10.1007/s11739-015-1362-x 45. Jawa Z. Risk factors of trastuzumab-induced cardiotoxicity in breast cancer / Jawa Z., Perez R. M., Garlie L. // Medicine (Baltimore). - 2016. – Vol. 95(44), - e5195. doi:10.1097/md.0000000000005195 46. Zelenetz A, Ahmed I, Braud E et al. NCCN Biosimilars White Paper: Regulatory, Scientific, and Patient Safety Perspectives. JNCCN 2011; 9 (Suppl. 4): S1-S22.